PCR（基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室）檢測(cè)微量感染因子時(shí)，操作人員容易因?yàn)槲廴径鴮?dǎo)致各種問(wèn)題。SLD中檢實(shí)驗(yàn)室技術(shù)根據(jù)多年行業(yè)經(jīng)驗(yàn)，給出的建議是：進(jìn)行PCR操作時(shí)，操作人員一定要嚴(yán)格遵守一些操作規(guī)程，最大程度地降低可能出現(xiàn)的PCR污染事故的發(fā)生。?


一、PCR實(shí)驗(yàn)室劃分操作區(qū)：?
    目前，對(duì)于普通PCR，業(yè)內(nèi)還無(wú)法做到單人單管和實(shí)現(xiàn)完全封閉管理操作，但無(wú)論是否能夠達(dá)到單人單管，均要求實(shí)驗(yàn)操作在三個(gè)不同的物理區(qū)域內(nèi)進(jìn)行，PCR的前處理和后處理一定要設(shè)計(jì)在不同的隔離區(qū)內(nèi)進(jìn)行：?
1、標(biāo)本處理區(qū)，包括：擴(kuò)增摸板制備;??
2、PCR擴(kuò)增區(qū)，包括：反應(yīng)液的配制和PCR基因擴(kuò)增;??
3、產(chǎn)物分析區(qū)，包括：凝膠電泳分析，產(chǎn)物拍照及重組克隆制備。??
各工作區(qū)要具有一定的隔離，操作器材要專(zhuān)用，而且要有一定方向性，如，?標(biāo)本制備→?PCR擴(kuò)增→?產(chǎn)物分析→④產(chǎn)物處理。切記：產(chǎn)物分析區(qū)的產(chǎn)物及器材嚴(yán)禁拿到前后兩個(gè)工作區(qū)，避免交叉污染。?


二、PCR實(shí)驗(yàn)室試劑分裝要求：?
    PCR擴(kuò)增所需要的試劑均應(yīng)在裝有紫外燈的負(fù)壓工作臺(tái)或超凈工作臺(tái)進(jìn)行配制和分裝，所有的吸頭和加樣器都需固定放于其中，吸頭不能用來(lái)吸取擴(kuò)增后的DNA和其它來(lái)源DNA：??
1、PCR用水應(yīng)為高壓的雙蒸水;?
2、引物和d-NTP用高壓的雙蒸水在無(wú)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物區(qū)配制;?
3、引物和d-NTP應(yīng)分裝儲(chǔ)存，分裝時(shí)應(yīng)標(biāo)明分裝時(shí)間，以備發(fā)生污染時(shí)及時(shí)查找原因和追溯污染源頭;??

三、PCR擴(kuò)增重要標(biāo)準(zhǔn)??
1、PCR實(shí)驗(yàn)靈敏度?
    PCR實(shí)驗(yàn)靈敏度：是指PCR擴(kuò)增反應(yīng)能夠檢測(cè)到目的基因的最小值。?研究結(jié)果表明，影響PCR擴(kuò)增效率的因素，有模板的完整性、反應(yīng)溫度、復(fù)雜程度、引物純度及其與模板結(jié)合效率、DNA聚合酶的熱穩(wěn)定性與擴(kuò)增性能、反應(yīng)緩沖液的離子組成(主要指：陽(yáng)離子)、反應(yīng)優(yōu)化劑等，這些因素都顯著影響
PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)靈敏度。在最佳擴(kuò)增條件下，常規(guī)PCR反應(yīng)能夠檢測(cè)到pg(10～12g)數(shù)量級(jí)目的基因。對(duì)于一個(gè)特定的目的基因，模板與引物通常都是已經(jīng)限定好的因素。因此，選擇什么樣的PCR反應(yīng)體系(包括DNA聚合酶與反應(yīng)緩沖液等)就是研究者提高PCR實(shí)驗(yàn)靈敏度的關(guān)鍵因素了。??
2、PCR實(shí)驗(yàn)特異性???
    PCR實(shí)驗(yàn)特異性：是指在PCR擴(kuò)增過(guò)程中，專(zhuān)一性擴(kuò)增目的片段而非其他
片段的性能。?
    在PCR實(shí)驗(yàn)本身的靈敏度很高，且實(shí)驗(yàn)條件未充分優(yōu)化的情況下，通常會(huì)在目的片段出現(xiàn)同時(shí)伴隨有其它雜帶，即發(fā)生非特異性擴(kuò)增現(xiàn)象。模板、引物性質(zhì)及質(zhì)量、反應(yīng)條件控制等均會(huì)影響PCR擴(kuò)增特異性。近年來(lái)的研究結(jié)果表明，緩沖液品質(zhì)(如反應(yīng)優(yōu)化劑、離子種類(lèi)與組成等)對(duì)保證PCR特異性擴(kuò)增起著重要作用。??
3、PCR靈敏性和特異性關(guān)聯(lián)?
    PCR實(shí)驗(yàn)靈敏度與特異性是一對(duì)此長(zhǎng)彼消特性，這也決定我們實(shí)驗(yàn)體系調(diào)節(jié)實(shí)際上就是需要找到適合實(shí)驗(yàn)靈敏度與特異性的平衡點(diǎn)。由于PCR體系中的成分眾多，使得組合較多，篩選工作也就相對(duì)繁雜。?四、PCR實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng)：?
    盡管PCR擴(kuò)增序列的殘留污染大部分是假陽(yáng)性反應(yīng)導(dǎo)致的，但樣品間的交叉污染也是常見(jiàn)原因之一。因此，不僅要在進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)要謹(jǐn)慎對(duì)待，在樣品的收集、抽提和擴(kuò)增的所有環(huán)節(jié)都應(yīng)謹(jǐn)慎操作，一般需做到以下幾點(diǎn)：?
1、戴一次性手套，若不小心濺上反應(yīng)液，應(yīng)立即更換手套;?
2、避免反應(yīng)液飛濺，若不小心濺到手套或桌面上，應(yīng)立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面;?
3、使用一次性吸頭，嚴(yán)禁與PCR產(chǎn)物分析室的吸頭混用，吸頭不要長(zhǎng)時(shí)間暴露于空氣中，避免空氣中氣溶膠的污染;?
4、操作多份樣品時(shí)，制備反應(yīng)混合液，先將dNTP、緩沖液、引物和酶混合好，然后再分裝，這樣既可以減少操作次數(shù)，避免污染，又可以增加反應(yīng)的精確度；?
5、最后加入反應(yīng)模板，加入后蓋緊反應(yīng)管;?
6、操作時(shí)設(shè)立空白對(duì)照和陰陽(yáng)性對(duì)照，既可驗(yàn)證PCR反應(yīng)的可靠性，又可
以協(xié)助判斷擴(kuò)增系統(tǒng)的可信性;?
7、由于實(shí)際操作時(shí)加樣器很容易受產(chǎn)物氣溶膠或標(biāo)本DNA的污染，所以操作者最好使用高壓處理過(guò)的或可替換的加樣器。假如沒(méi)有這種特殊的加樣器，至少在PCR操作過(guò)程中加樣器應(yīng)該專(zhuān)用，嚴(yán)禁交叉使用，尤其是PCR產(chǎn)物分析所用加樣器不能拿到其它兩個(gè)相鄰區(qū)域使用;?
8、重復(fù)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證結(jié)果，慎下結(jié)論。?

五、綜述：?
    由于PCR實(shí)驗(yàn)操作非常專(zhuān)業(yè)，在設(shè)計(jì)PCR基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室時(shí)設(shè)計(jì)師也要充分考慮上述技術(shù)要求，避免PCR實(shí)驗(yàn)室在后續(xù)使用時(shí)出現(xiàn)返工、返修問(wèn)題。